T4-DNA-Polymerase

DNA-directed DNA polymerase
DNA-directed DNA polymerase
Bändermodell der T4-DNA-Polymerase nach PDB 1NOY
Andere Namen

Gene product 43, Gp43

Vorhandene Strukturdaten: PDB 1NOY, PDB 1NOZ

Masse/Länge Primärstruktur898 Aminosäuren, 103.610 Da
Bezeichner
Externe IDs
Enzymklassifikation
EC, Kategorie2.7.7.7
Orthologe (Bakteriophage T4)
Entrez1258685
UniProtP04415
Refseq (Protein)NP_049662.1
PubMed-Suche1258685

T4-DNA-Polymerase ist ein Enzym aus der Gruppe der DNA-Polymerasen, das vom Gen 43 des Bakteriophagen T4 codiert wird.

Eigenschaften

Die T4-DNA-Polymerase dient dem Bakteriophagen T4 zur Replikation des viralen Genoms. Die T4-DNA-Polymerase besitzt zwei Enzymaktivitäten: eine Polymerase-Aktivität, die eine DNA-Synthese vom 5'- zum 3'-Ende katalysiert und eine 3'→5' -Exonuklease-Aktivität, die sogenannte Korrekturlese-Funktion (engl. proof reading), die es ermöglicht, den Einbau eines unpassenden Nukleotids zu erkennen und dieses anschließend wieder aus der DNA zu entfernen. Im Gegensatz zur DNA-Polymerase I aus E. coli fehlt ihr eine 5'→3'-Exonuklease-Aktivität. Die T4-DNA-Polymerase nutzt stets einen bereits bestehenden DNA-Einzelstrang als Matrize (Vorlage) für die Synthese eines neuen, komplementären Stranges. Voraussetzung für die Polymeraseaktivität sind ein 5‘-DNA-Überhang und eine hohe Konzentration an dNTPs.[1] Hohe Konzentrationen an dNTPs inhibieren die Exonukleaseaktivität. Die Exonukleaseaktivität zeigt eine im Vergleich zu doppelsträngiger DNA etwa 100-fache erhöhte Präferenz für Einzelstränge.[2] Als Cofaktor werden zweiwertige Magnesiumionen verwendet.

Funktion

Der Bakteriophage T4 codiert für alle Proteine, die er für seine Replikation benötigt. In den 1960er Jahren ist es gelungen Genkarten für das T4-Genom zu erstellen.[3][4] 1964 gelang die Identifizierung des Gen 43 als Strukturgen für T4-DNA-Polymerase, die daher auch T4-gp43-DNA-Polymerase genannt wird.[5] T4-DNA-Polymerase ist eines von zehn Proteinen des T4-Replisoms, zu dem auch die T4-DNA-Ligase gehört.[6] T4-DNA-Polymerase gehört, wie die eukaryontische Pol α, zur Pol-B-Familie.[7] Als DNA-Klammer wird gp45 des Bakteriophagen T4 verwendet.

Anwendungen

Die T4-DNA-Polymerase wird in der Molekularbiologie zur Entfernung von 3´-Überhängen und zum Auffüllen (fill-in) von 5‘-Überhängen zur Erzeugung von glatten Enden (blunt ends) eingesetzt. Diese Funktion wird bei der Klonierung von DNA-Molekülen genutzt, die mit Restriktionsenzymen erzeugt wurden. Das Enzym wird auch zur Markierung von DNA-Molekülen eingesetzt, wobei man die Kombination von Exonuklease- und Polymeraseaktivität nutzen kann.[8] Ein Vorteil der T4-DNA-Polymerase bei der Zweitstrangsynthese während der cDNA-Klonierung ist die hohe Genauigkeit. Bei der ortsspezifischen DNA-Mutagenese findet sie Anwendung wegen der fehlenden strand displacement-Aktivität.

Literatur

  • E. S. Miller, E. Kutter, G. Mosig, F. Arisaka, T. Kunisawa, W. Rüger: Bacteriophage T4 genome. In: Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. Band 67, Nummer 1, März 2003, S. 86–156, PMID 12626685, PMC 150520 (freier Volltext).

Einzelnachweise

  1. ↑ DNA Polymerase, T4 - Worthington Enzyme Manual. In: worthington-biochem.com. Abgerufen am 10. Dezember 2016 (englisch).
  2. ↑ W. M. Huang, I. R. Lehman: On the exonuclease activity of phage T4 deoxyribonucleic acid polymerase. In: The Journal of Biological Chemistry. Band 247, Nummer 10, Mai 1972, S. 3139–3146, PMID 4554914.
  3. ↑ R. S. EDGAR, I. LIELAUSIS: TEMPERATURE-SENSITIVE MUTANTS OF BACTERIOPHAGE T4D: THEIR ISOLATION AND GENETIC CHARACTERIZATION. In: Genetics. Band 49, April 1964, S. 649–662, PMID 14156925, PMC 1210603 (freier Volltext).
  4. ↑ R. S. EDGAR, G. H. DENHARDT, R. H. EPSTEIN: A COMPARATIVE GENETIC STUDY OF CONDITIONAL LETHAL MUTATIONS OF BACTERIOPHAGE T4D. In: Genetics. Band 49, April 1964, S. 635–648, PMID 14156924, PMC 1210602 (freier Volltext).
  5. ↑ A. De Waard, A. V. Paul, I. R. Lehman: The structural gene for deoxyribonucleic acid polymerase in bacteriophages T4 and T5. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Band 54, Nummer 4, Oktober 1965, S. 1241–1248, PMID 5219829, PMC 219850 (freier Volltext).
  6. ↑ T. C. Mueser, J. M. Hinerman, J. M. Devos, R. A. Boyer, K. J. Williams: Structural analysis of bacteriophage T4 DNA replication: a review in the Virology Journal series on bacteriophage T4 and its relatives. In: Virol. J. Band 7, Dezember 2010, S. 359, doi:10.1186/1743-422X-7-359, PMID 21129204, PMC 3012046 (freier Volltext) (Review).
  7. ↑ J. D. Karam, W. H. Konigsberg: DNA polymerase of the T4-related bacteriophages. In: Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. Band 64, 2000, S. 65–96, PMID 10697407 (Review).
  8. ↑ K. C. Deen, T. A. Landers, M. Berninger: Use of T4 DNA polymerase replacement synthesis for specific labeling of plasmid-cloned inserts. In: Anal. Biochem. Band 135, Nummer 2, Dezember 1983, S. 456–465, PMID 6318604.

Auf dieser Seite verwendete Medien

T4-DNA-Polymerase.png
Autor/Urheber: ChemPro, Lizenz: CC0
Bändermodell der T4-DNA-Polymerase, nach PDB: 1NOY​