Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

Die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (englisch reverse transcription polymerase chain reaction, kurz RT-PCR) ist die Kombination von zwei Methoden der Molekularbiologie – die Nutzung der Reversen Transkriptase (RT) und der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) – um RNA nachzuweisen, wie z. B. die Genexpression von spezifischen Genen in Zellen, Geweben und Blutserum oder auch Ribozyme, Ribonukleoproteine oder das Genom von RNA-Viren. Verwendet wird die RT-PCR in Forschung und Diagnostik.

Die Abkürzung RT-PCR bezeichnet gelegentlich auch die Real Time Quantitative PCR, was zu Verwechslungen führen kann, weshalb diese häufiger mit qPCR abgekürzt wird. Eine Kombination von RT-PCR und qPCR wird dann als RT-qPCR bezeichnet.

Geschichte

Reverse Transkriptasen wurden 1970 gleichzeitig durch Howard M. Temin im Rous-Sarkom-Virus (RSV) und durch David Baltimore im RSV und im Moloney Murine Leukemia Virus (MoMLV) entdeckt.[1][2] Für ihre Entdeckung erhielten beide 1975 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin, gemeinsam mit Renato Dulbecco. Die Erzeugung von cDNA aus RNA mit Hilfe von reversen Transkriptasen wurde erstmals im Jahr 1971 beschrieben.[3] Die anschließende Amplifikation der erzeugten cDNA erfolgte erstmals 1976 mittels DNA-Polymerasen.[4] Die Verwendung von thermostabilen DNA-Polymerasen erfolgte erstmals 1989.[5] Im Jahr 1990 wurde erstmals eine RT-PCR in einem Reaktionsansatz (engl. One-Step-RT-PCR) durchgeführt.[6][7] Die Spezifität der Reaktion konnte durch Hot-Start-DNA-Polymerasen erhöht werden.

Prinzip

Die RT-PCR ist ein in der Regel dreistufiger Prozess: nach einer RNA-Reinigung wird die RNA in DNA umgeschrieben, dann Teile der DNA spezifisch vermehrt. Um die Transkription eines Genes, des Transkriptoms, eines Ribozym, von Ribonukleoproteinen oder das Genom von RNA-Viren nachzuweisen, muss die RNA untersucht werden. Daher wird zuerst eine Reverse Transkriptase (RT) eingesetzt, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, mit deren Hilfe RNA in cDNA umgeschrieben werden kann. Bei einer anschließenden Amplifikation von DNA durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden spezifische thermostabile DNA-Polymerasen verwendet, die DNA-abhängig sind, d. h., sie sind nicht in der Lage, RNA zu amplifizieren. Die cDNA kann im Anschluss als Ausgangsmaterial in einer PCR verwendet werden, um spezifische Sequenzen aus dieser zu amplifizieren. Meistens wird zwischen der reversen Transkription und der PCR ein zehnminütiges Erhitzen auf 95 °C verwendet, bei der die reverse Transkriptase denaturiert wird. Die Produkte der RT-PCR lassen sich gelelektrophoretisch untersuchen und anschließend klonieren oder sequenzieren.

Die heute eingesetzten Reversen Transkriptasen sind veränderte Enzymvarianten aus unterschiedlichen Retroviren, wie die des Moloney Murine Leukemia Virus (MoMLV)[8] oder des Avian Myeloblastosis Virus (AMV).[9] Die verschiedenen Varianten des Enzyms sind je nach Hersteller derart modifiziert worden, dass sie eine höhere Spezifität oder bessere Erträge generieren können, beispielsweise wird die im Enzym natürlich vorkommende RNase H-Aktivität deletiert.[10][11] Konventionelle zur RT-PCR verwendete reverse Transkriptasen retroviralen Ursprungs, wie die AMV- und die MoMuLV-Reverse-Transkriptase, sind bei 95 °C nicht thermostabil. Bei den niedrigeren Temperaturen einer reversen Transkription mit diesen Enzymen kommen jedoch unspezifische Bindungen von Primern an die DNA-Vorlage und Sekundärstrukturen in der DNA-Vorlage vor, welche zu unerwünschten Produkten führen und die Synthese des korrekten Produkts verhindern können. Allerdings kann die reverse Transkriptase von AMV bis zu 70 °C eingesetzt werden.[12] Bei der reversen Transkriptase von MoMuLV wurden thermostabilere RNaseH-negative Mutante beschrieben (Mutationen E69K, E302R, W313F, L435G, N454K).[13] Weiterhin wurde die Vorlagenspezifität thermostabiler DNA-Polymerasen durch Austausch des Cofaktors (zweiwertige Magnesiumionen) gegen zweiwertige Mangansalze herabgesetzt, so dass mit einer DNA-abhängigen thermostabilen Polymerase auch RNA in einer RT-PCR als Vorlage zur Synthese von DNA eingesetzt werden konnte.[5] Da die Syntheserate der Taq-Polymerase mit Manganionen relativ niedrig war, wurde bei dieser Variante der RT-PCR zunehmend die Tth-Polymerase eingesetzt.[14] Jedoch erhöhte die Zugabe von Manganionen auch die Anzahl fehlerhafter Produkte und erhöhte die notwendige Menge an Vorlagen-DNA, weshalb diese Enzyme heute kaum noch zur reversen Transkription eingesetzt werden. Diese Probleme konnten mit der thermostabilen 3173-Polymerase aus thermophilen Bakteriophagen vermieden werden, welche die hohen Temperaturen einer PCR für eine längere Zeit übersteht und RNA als Vorlage bevorzugt.[15]

Als RNA-abhängige DNA-Polymerase benötigt die Reverse Transkriptase ein kurzes DNA-Stück, einen so genannten Primer, zur Initiation der Synthese der Komplementär-DNA (cDNA). Zur Analyse von poly-A-tragender mRNA wird hier ein sogenannter Oligo-d(T)-Primer verwendet, also mehrere Thymin-Basen, welche komplementär zum Poly(A)-Schwanz am 3'-Ende der mRNA sind.

Sehr kurze RNA-Moleküle wie reife microRNAs sind viel zu klein (17–22 Basen) für den Einsatz üblicher Primer. Daher werden zur reversen Transkription dieser Nukleinsäuren besondere Schleifen-Primer eingesetzt, die nur am 3´Ende mit unter 10 Basen hybridisieren und so selektiv reife microRNAs (statt mRNAs) umschreiben.

Erst im zweiten Schritt der RT-PCR werden Gen-spezifische Primer eingesetzt. Bei einer modifizierten Variante, der One-Step RT-PCR, werden stattdessen direkt Gen-spezifische Primer verwendet und beide Reaktionen werden hintereinander im selben Gefäß ausgeführt. Bei der Zero-Step RT-PCR entfällt darüber hinaus der isothermale Zwischenschritt, der sonst bei der reversen Transkription und vor der PCR-Reaktion durchgeführt wird. Durch die hohe Thermostabilität des biotechnologisch veränderten Enzyms können beide Reaktionen parallel im selben Gefäß ablaufen. Gleichzeitig werden durch die höhere Temperatur von über 55 °C Sekundärstrukturen der RNA dauerhaft aufgebrochen. Eine weitere Variante der RT-PCR ist die RACE-PCR.

Anwendungen

Da eine cDNA zur ursprünglichen mRNA komplementär ist, kann aus dieser anhand des genetischen Codes auch die Aminosäurensequenz eines Proteins abgeleitet werden, für welches diese mRNA codiert. Da eine mRNA in Eukaryoten nach ihrer Transkription bereits modifiziert und gespleißt wurde, ist sie im Gegensatz zum Gen auch Intron-frei. Darüber hinaus ermöglicht diese cDNA auch Informationen darüber zu erhalten, ob das dazugehörige Gen in verschiedenen Isoformen exprimiert wird, d. h., die mRNA alternativ gespleißt wird. Über RT-PCR lässt sich also gezielt Genexpression nachweisen. Genutzt wird die RT-PCR auch bei der Diagnose von RNA-Viren im Blutserum, wie HIV und in jüngerer Zeit häufig auch im Zusammenhang mit Influenza A/H5N1 und SARS-CoV-2.

Bei einem Northern Blot können die Hybridisierungssonden per RT-PCR hergestellt werden. Zur Analyse des Transkriptoms wird die gesamte RNA in einer RT-PCR mit einer Mischung kurzer Primer (engl. random hexamers) in cDNA umgeschrieben und kopiert. Im Anschluss erfolgt meistens ein Microarray oder eine Sequenzierung der cDNAs. Hier reicht häufig die Ermittlung von Expressed Sequence Tags (EST) zur Identifizierung der Transkripte.

Qualitätssicherung

Zur Qualitätssicherung der Methodik fanden bereits umfangreiche Untersuchungen statt.[16][17][18] Auch CDC-Untersuchungen gemäß der ISO-Norm hier jedoch für die Real Time Quantitative PCR wurden im internationalen Rahmen durchgeführt, die auch veterinärmedizinisches Untersuchungsgut betrafen.[19]

Literatur

  • Cornel Mülhardt: Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics. Sechste Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2008, ISBN 3-8274-2036-9.
  • J. Sambrook, T. Maniatis, D. W. Russel: Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd edition (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-577-3

Einzelnachweise

  1. ↑ H. M. Temin, S. Mizutani: RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. In: Nature (1970), Band 226(5252), S. 1211–3. Erratum in: Nature. 1970 227(5253):102. PMID 4316301.
  2. ↑ Baltimore D: RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. In: Nature. 226. Jahrgang, Nr. 5252, Juni 1970, S. 1209–11, doi:10.1038/2261209a0, PMID 4316300.
  3. ↑ S. Spiegelman, K. F. Watson, D. L. Kacian: Synthesis of DNA complements of natural RNAs: a general approach. In: Proc Natl Acad Sci U S A. (1971), Band 68(11), S. 2843–5. PMID 4330945; PMC 389539 (freier Volltext).
  4. ↑ A. Efstratiadis, F. C. Kafatos, A. M. Maxam, T. Maniatis: Enzymatic in vitro synthesis of globin genes. In: Cell (1976), Band 7(2), S. 279–88. PMID 60178.
  5. ↑ a b A. M. Carothers, G. Urlaub, J. Mucha, D. Grunberger, L. A. Chasin: Point mutation analysis in a mammalian gene: rapid preparation of total RNA, PCR amplification of cDNA, and Taq sequencing by a novel method. In: Biotechniques (1989), Band 7(5), S. 494–6, 498-9. PMID 2483818.
  6. ↑ A. L. Shaffer, W. Wojnar, W. Nelson: Amplification, detection, and automated sequencing of gibbon interleukin-2 mRNA by Thermus aquaticus DNA polymerase reverse transcription and polymerase chain reaction. In: Anal Biochem. (1990), Band 190(2), S. 292–6. PMID 2291473.
  7. ↑ L. N. Sellner, R. J. Coelen, J. S. Mackenzie: Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. In: Nucleic Acids Res. (1992), Band 20(7), S. 1487–90. PMID 1374554; PMC 312227 (freier Volltext).
  8. ↑ M. J. Roth, N. Tanese, S. P. Goff: Purification and characterization of murine retroviral reverse transcriptase expressed in Escherichia coli. In: Journal of Biological Chemistry. Band 260, Nummer 16, August 1985, S. 9326–9335, PMID 2410413.
  9. ↑ F. Mallet, G. Oriol, C. Mary, B. Verrier, B. Mandrand: Continuous RT-PCR using AMV-RT and Taq DNA polymerase: characterization and comparison to uncoupled procedures. In: BioTechniques. Band 18, Nummer 4, April 1995, S. 678–687, PMID 7541215.
  10. ↑ A. Telesnitsky, S. P. Goff: RNase H domain mutations affect the interaction between Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase and its primer-template. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 90, Nummer 4, Februar 1993, S. 1276–1280, PMID 7679498, PMC 45855 (freier Volltext).
  11. ↑ L. Lu, T. Nakano, G. A. Smallwood, T. G. Heffron, B. H. Robertson, C. H. Hagedorn: A refined long RT-PCR technique to amplify complete viral RNA genome sequences from clinical samples: application to a novel hepatitis C virus variant of genotype 6. In: Journal of virological methods. Band 126, Nummer 1–2, Juni 2005, S. 139–148, doi:10.1016/j.jviromet.2005.01.031, PMID 15847930.
  12. ↑ B. Fuchs, K. Zhang, M. G. Rock, M. E. Bolander, G. Sarkar: High temperature cDNA synthesis by AMV reverse transcriptase improves the specificity of PCR. In: Molecular biotechnology. Band 12, Nummer 3, Oktober 1999, S. 237–240, doi:10.1385/MB:12:3:237, PMID 10631680.
  13. ↑ B. Arezi, M. McCarthy, H. Hogrefe: Mutant of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase exhibits higher resistance to common RT-qPCR inhibitors. In: Analytical biochemistry. Band 400, Nummer 2, Mai 2010, S. 301–303, doi:10.1016/j.ab.2010.01.024, PMID 20100452.
  14. ↑ T. W. Myers, D. H. Gelfand: Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. In: Biochemistry (1991), Band 30(31), S. 7661–6. PMID 1714296.
  15. ↑ M. J. Moser, R. A. DiFrancesco, K. Gowda, A. J. Klingele, D. R. Sugar, S. Stocki, D. A. Mead, T. W. Schoenfeld: Thermostable DNA polymerase from a viral metagenome is a potent RT-PCR enzyme. In: PLoS One (2012), Band 7(6), S. e38371. doi:10.1371/journal.pone.0038371. PMID 22675552; PMC 3366922 (freier Volltext).
  16. ↑ Jiang Y, Cai D, Chen D, Jiang S: The cost-effectiveness of conducting three versus two reverse transcription-polymerase chain reaction tests for diagnosing and discharging people with COVID-19: evidence from the epidemic in Wuhan, China., BMJ Glob Health. 2020 Jul;5(7):e002690, PMID 32694221
  17. ↑ Ambrosi C, Prezioso C, Checconi P, Scribano D, Sarshar M, Capannari M, Tomino C, Fini M, Garaci E, Palamara AT, De Chiara G, Limongi D: SARS-CoV-2: Comparative analysis of different RNA extraction methods.J Virol Methods. 2021 Jan;287:114008, PMID 33160015
  18. ↑ Reijns MAM, Thompson L, Acosta JC, Black HA, Sanchez-Luque FJ, Diamond A, Parry DA, Daniels A, O’Shea M, Uggenti C, Sanchez MC, O’Callaghan A, McNab MLL, Adamowicz M, Friman ET, Hurd T, Jarman EJ, Chee FLM, Rainger JK, Walker M, Drake C, Longman D, Mordstein C, Warlow SJ, McKay S, Slater L, Ansari M, Tomlinson IPM, Moore D, Wilkinson N, Shepherd J, Templeton K, Johannessen I, Tait-Burkard C, Haas JG, Gilbert N, Adams IR, Jackson AP: A sensitive and affordable multiplex RT-qPCR assay for SARS-CoV-2 detection., PLoS Biol. 2020 Dec 15;18(12):e3001030, PMID 33320856.
  19. ↑ Deng K, Uhlig S, Ip HS, Lea Killian M, Goodman LB, Nemser S, Ulaszek J, Pickens S, Newkirk R, Kmet M, Frost K, Hettwer K, Colson B, Nichani K, Schlierf A, Tkachenko A, Reddy R, Reimschuessel R: Interlaboratory comparison of SARS-CoV2 molecular detection assays in use by U.S. veterinary diagnostic laboratories., J Vet Diagn Invest. 2021 Nov;33(6):1039-1051, PMID 34293974.