Plasmidkopienzahl

Die Plasmidkopienzahl beschreibt die Zahl an Plasmiden einer Art pro Zelle.

Man unterscheidet zwischen

  • low-copy Plasmidkopienzahl zwischen 1 und 12 pro Zelle
  • medium-copy Plasmidkopienzahl zwischen 15 und 20 pro Zelle
  • high-copy Plasmidkopienzahl zwischen 20 und 700 pro Zelle[1]

Die Unterschiede in der Kopienzahl entstehen durch die unterschiedliche Funktionsweise des origin of replication und der in ihm codierten Gene. Die Sequenz des Plasmids P15A beispielsweise führt zur Ausprägung des low-copy-Typs, jene vom Plasmid pBR322 zum medium-copy Typ. Eine einfache Punktmutation im Gen für die RNA II des oris des pBR322-Plasmids, kombiniert mit der Deletion eines Kontrollproteins, zum high-copy Typ.[2] Auch andere Mutationen können zur Erhöhung der Kopienzahl führen.[3] Kopienzahl und Wachstum von plasmidhaltigen Zellen beeinflussen sich wechselseitig. Eine hohe Kopienzahl bedeutet eine hohe metabolische Belastung der Zellen und führt unter Umständen zu deutlich verringertem Wachstum.[4][5] Die Wachstumsgeschwindigkeit einer Zelle wiederum beeinflusst die Kopienzahl. Eine Verringerung der Wachstumsgeschwindigkeit sorgt für einen Anstieg der Kopienzahl.[6]

Zur Produktion rekombinanter Proteine werden meist Plasmide der Kategorie high-copy eingesetzt. Für diesen Einsatz gelten drei Regeln die nacheinander Anwendung bei der Optimierung der Expressionsleistung finden:

  • Hohe Plasmidkopienzahl führt zu hoher Genexpression,[7] allerdings auch zu höherer Toxizität toxischer Proteine.[8]
  • Erfolgt trotz Erhöhung der Kopienzahl keine Steigerung der Menge an Expressionsprodukt so besagt die zweite Regel, dass die Produktion von Expressionsprodukten den Limitierungen des Zellmetabolismus unterliegt,[9] da die Transkriptions- bzw. Translationskapazitäten der Zellen erschöpft sein können.[10]
  • Die dritte Regel besagt, dass auch die Verringerung der Kopienzahl zur Steigerung der Produktmenge führen kann, dass das Plasmid stabiler[11] und damit leistungsfähiger für das gewünschte Produkt ist. Gerade für die Expression von Proteinen, die toxisch für den Wirt sind, eignen sich häufig low-copy-Plasmide.[12]

Definition der Plasmidkopienzahl

Es existieren in der Fachliteratur unterschiedliche Definitionen der Plasmidkopienzahl. Die zwei häufigsten definieren die Kopienzahl als Plasmidkopien pro Zelle[13] oder als Plasmidkopien pro Chromosom.[14] Weiterhin üblich sind Mengenangaben wie z. B. fmol Plasmid pro mg Trockenbiomasse[15], relative Angaben die einen Bezug zu einem Vergleichsplasmid herstellen, wie etwa x-fache Kopienzahl bezogen auf ein Wildtypplasmid[16] oder ein Wert für die Produktausbeute mg Plasmid-DNA pro g Zelltrockengewicht.[17]

Bestimmung der Plasmidkopienzahl

Es gibt verschiedene direkte und indirekte Methoden die Plasmidkopienzahl zu bestimmen. Beim Einsatz indirekter Methoden werden nicht die Plasmide direkt, sondern Genprodukte quantifiziert, wie etwa die Messung der Aktivität von plasmidkodierter β-Lactamase.[18] Hierbei wird ein direkter proportionaler Zusammenhang zwischen Enzymaktivität und Plasmidkopienzahl angenommen. Diese Annahme trägt jedoch nicht der Tatsache Rechnung, dass die Expression eines Enzyms und die Enzymaktivität von anderen Faktoren beeinflusst werden die unabhängig von der Plasmidkopienzahl sind. Daher ist diese Methode nur eingeschränkt nutzbar.[19] Ähnliche Systeme existieren mit anderen Reporterproteinen wie Luziferase.[20]

Bei direkten Methoden zur Bestimmung der Kopienzahl wird die Plasmidmenge nach einem Zellaufschluss bestimmt. Neben der Dot-Blot-Methode, bei der die Plasmidmenge häufig durch radioaktiv markierter Gensonden bestimmt wird <...?>.[21]

Am häufigsten erfolgt hierbei nach dem Zellaufschluss eine Isolierung bzw. eine Trennung der Plasmide von der chromosomalen DNA. Die hierfür verwendeten Methoden sind HPLC,[22] Dichtegradientenzentrifugation[23] oder Gelelektrophorese[24] sowie gepulste Gelelektrophorese.[25] Die Plasmidmenge wird hierbei über unterschiedliche Methoden quantifiziert. Etwas durch UV-Absorption bei der HPLC oder durch die Messung der Radioaktivität bei einer Dichtegradientenzentrifugation. Hierzu müssen vorher bei der Replikation der Plasmide Radionuklide für den Einbau vorgelegt werden. Ebenfalls zur Quantifizierung der Plasmide nach einer Gelelektrophorese kann ein Southern Blot eingesetzt werden oder auch durch markierte Gensonden erfolgen.[26]

Die Bestimmung von Plasmidkopienzahlen nach den genannten Methoden erzeugt immer einen Durchschnittswert, der durch plasmidfreie Zellen in der Kultur stark verfälscht werden kann.

Einzelnachweise

  1. ↑ Mayer M.P. (1995): A new set of useful cloning and expression vectors derived from pBluescript. Gene 163 41-46.
  2. ↑ I. Boros, G. Pósfai, P. Venetianer: High-copy-number derivatives of the plasmid cloning vector pBR322. In: Gene. Band 30, Nummer 1–3, Oktober 1984, S. 257–260, PMID 6096220.
  3. ↑ A. K. Müller, F. Rojo, J. C. Alonso: The level of the pUB110 replication initiator protein is autoregulated, which provides an additional control for plasmid copy number. In: Nucleic acids research. Band 23, Nummer 11, Juni 1995, S. 1894–1900, PMID 7596815, PMC 306960 (freier Volltext).
  4. ↑ C. Anthony Mason, JamesE. Bailey: Effects of plasmid presence on growth and enzyme activity of Escherichia coli DH5?. In: Applied Microbiology and Biotechnology. 32, 1989, doi:10.1007/BF00164823.
  5. ↑ Jung Hyun Lee, Kye Joon Lee: Analysis of expression rate of cloned β-lactamase gene in a recombinant of Streptomyces lividans. In: Journal of Biotechnology. 52, 1996, S. 161, doi:10.1016/S0168-1656(96)01633-1.
  6. ↑ Kramer W., Mattanovitch D., Elmecker G., Weik R., Luettich C., Bayer K., Katinger H. (1994): Regulable expression systems for the optimisation of recombinant protein production in Escherichia coli. Prog. Biotechnol. 9 827-830.
  7. ↑ C. French, J. M. Ward: Production and modification of E. coli transketolase for large-scale biocatalysis. In: Annals of the New York Academy of Sciences. Band 799, Oktober 1996, S. 11–18, PMID 8958067.
  8. ↑ M. P. Mayer: A new set of useful cloning and expression vectors derived from pBlueScript. In: Gene. Band 163, Nummer 1, September 1995, S. 41–46, PMID 7557476.
  9. ↑ V. Nacken, T. Achstetter, E. Degryse: Probing the limits of expression levels by varying promoter strength and plasmid copy number in Saccharomyces cerevisiae. In: Gene. Band 175, Nummer 1–2, Oktober 1996, S. 253–260, PMID 8917107.
  10. ↑ Jeong-Yoon Kim, Dewey D. Y. Ryu: The effects of plasmid content, transcription efficiency, and translation efficiency on the productivity of a cloned gene protein in Escherichia coli. In: Biotechnology and Bioengineering. 38, 1991, S. 1271, doi:10.1002/bit.260381103.
  11. ↑ S. La Fontaine, S. D. Firth, P. J. Lockhart, J. A. Paynter, J. F. Mercer: Eukaryotic expression vectors that replicate to low copy number in bacteria: transient expression of the Menkes protein. In: Plasmid. Band 39, Nummer 3, 1998, S. 245–251, doi:10.1006/plas.1997.1334, PMID 9571140.
  12. ↑ J. Müller, J. M. van Dijl, G. Venema, S. Bron: Cloning of heterologous genes specifying detrimental proteins on pUC-derived plasmids in Escherichia coli. In: Molecular & general genetics : MGG. Band 252, Nummer 1–2, August 1996, S. 207–211, PMID 8804394.
  13. ↑ Leipold R.J., Krewson C.E., Dhurjati P. (1994): Mathematical model of temperaturesensitive plasmid replication. Plasmid 32 131-167.
  14. ↑ Kiewiet R.J., Kok J.F. Seegers M.L., Venema G., Bron. S. (1993): The mode of replication is a major factor in segregational plasmid instability in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 59 358-364.
  15. ↑ Schendel F.J., Baude E.J., Flickinger. M.C. (1989): Determination of protein expression and plasmid copy number from cloned genes in Escherichia coli by flow injection analysis using an enzyme indicator vector. Biotechnol. Bioeng. 34 1023-1036.
  16. ↑ Austin S. J., Eichorn B.G. (1992): Random diffusion can account for topA-dependent suppression of partition defects in low-copy-number plasmids. J. Bacteriol. 174 5190-5195.
  17. ↑ Schmidt T., Friehs K., Flaschel E. (1996): Rapid determination of plasmid copy number. J. Biotechnol. 49 219-229.
  18. ↑ Miller C.A., Cohen S.N. (1993): The partition par locus of pSC101 is an enhancer of plasmid incompatibility. Mol. Microbiol. 9 695-702.
  19. ↑ Betenbaugh M.J., di Pasquantonio V.M., Dhurjati P. (1987): Growth kinetics of Escherichia coli containing temperature-sensitive plasmid pOU140. Biotechnol. Bioeng. 29 1164-1172.
  20. ↑ Coronado C., Vazquez M.E., Cebolla A., Palomares A.J. (1994): Use of firefly luciferase gene for plasmid copynumber determination. Plasmid 32 336-341.
  21. ↑ Hinnebusch J., Barbour A.G. (1992): Linear- and circular-plasmid copy numbers in Borrelia burgdorferi. J. Bacteriol. 174 5251-5257.
  22. ↑ Coppella S.J., Acheson C.M., Dhurjati P. (1987): Measurement of copy number using HPLC. Biotechnol. Bioeng. 29 646-647.
  23. ↑ Weaver K.E., Clewell D.B., An F. (1993): Identification characterization and nucleotide sequence of a region of Enterococcus faecalis pheromone-responsive plasmid pAD1 capable of autonomous replication. J. Bacteriol. 175 1900-1909.
  24. ↑ Projan S.J., Carleton S., Novick R.P. (1983): Determination of plasmid copy number by fluorescence densitometry. Plasmid 9 182-190.
  25. ↑ Ward A.C., Hillier A.J., Davidson B.E., Powell I.B. (1993): Stability analysis of the Lactococcus lactis DRC1 lactose plasmid using pulsed-field gel electrophoresis. Plasmid 29 70-73.
  26. ↑ Olsson T., K.Ekwall, T. Rusla. (1993): The silent P mating type locus in fission yeast contains two autonomously replicating sequences. Nucleic Acids Res. 21 855-861.