Multidisplacement Amplification

Die multiple-displacement amplification (MDA), auch strand-displacement amplification (SDA) oder isothermal multiple -displacement amplification (IMDA) ist eine Methode zur Vermehrung von geringen Mengen an DNA als Ausgangsmaterial. Sie ist eine Variante der isothermalen DNA-Amplifikation.

Eigenschaften

Im Vergleich zur Polymerase-Kettenreaktion eignet sich diese Methode besonders für die Vermehrung von langen DNA-Sequenzen (mehr als 2.000 bis 100.000 Basenpaare). Ein weiterer Vorteil ist, dass es bei Gemischen von DNA durch diese Art der Amplifikation keine Verzerrung (engl. bias) gibt, d. h., dass bei Gemischen nicht einzelne DNA-Sequenzen bevorzugt werden bzw. andere benachteiligt.

Aufgrund dieser Eigenschaften eignet sich diese Methode besonders zur Vermehrung von z. B. hochkomplexen Gemischen genomischer DNA. Als Ausgangsmaterial reichen wenige Nanogramm (z. B. die DNA von einigen hundert Zellen), welches bei der MDA mithilfe von DNA-Polymerase etwa 1000- bis 10.000fach vermehrt wird.

Prinzip

Die MDA wird im Vergleich zur Polymerase-Kettenreaktion bei gleichbleibender Temperatur durchgeführt.[1] Zunächst wird die doppelsträngige Template-DNA mittels Denaturierung in Einzelstränge getrennt. Anschließend wird die Φ29-DNA-Polymerase und ein Gemisch aus Desoxynukleotiden hinzugefügt. Die Φ29-DNA-Polymerase lagert sich an die Einzelstränge der DNA an und stellt danach den zweiten komplementären Strang her. Der komplementäre Strang wird dabei pro Sekunde etwa 25 bis 50 Basen mit einer Fehlerrate von 1 Fehler auf 3 × 106 Basen verlängert. Im Vergleich dazu: bei einer konventionellen PCR mit Taq-Polymerase rechnet man mit einer Geschwindigkeit von 1000 bis 2000 Basen pro Minute und einer Fehlerrate von 1 Fehler auf 2 × 103 Basen. Alternative isothermale Verfahren zur Erzeugung neuer DNA-Sequenzen sind z. B. das isothermal assembly und das circular polymerase extension cloning (CPEC).[2]

Alternative Methoden zur Amplifikation von DNA sind z. B. die Polymerasekettenreaktion, die nicking enzyme amplification reaction, die isothermal assembly, die loop-mediated isothermal amplification (LAMP), nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), die helicase-dependent amplification (HDA), die recombinase polymerase amplification und die rolling circle replication (RCA).[3] Weitere Nachweisverfahren sind z. B. die nicking endonuclease signal amplification (NESA) und nicking endonuclease assisted nanoparticle activation (NENNA), exonuclease-aided target recycling, junction or Y-probes, split DNAZyme und deoxyribozyme amplification (die beiden letzteren Methoden nutzen DNAzyme alias Desoxyribozyme), nicht-kovalente DNA-Katalysen und die hybridization chain reaction (HCR).[4]

Literatur

  • Rajyalakshmi Luthra, L. Jeffrey Medeiros: Isothermal Multiple Displacement Amplification – A Highly Reliable Approach for Generating Unlimited High Molecular Weight Genomic DNA from Clinical Specimens. In: J. Mol. Diagn. Bd. 6, Nr. 3, 2004, S. 236–242, PMID 15269301.
  • Frank B. Dean et al.: Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Bd. 99, Nr. 8, 2002, S. 5261–5266, PMID 11959976.
  • Pooria Gill, Amir Ghaemi: Nucleic acid isothermal amplification technologies: a review. In: Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids Bd. 27, Nr. 3, 2008, S. 224–43, PMID 18260008.

Einzelnachweise

  1. ↑ L. Westin, X. Xu, C. Miller, L. Wang, C. F. Edman, M. Nerenberg: Anchored multiplex amplification on a microelectronic chip array. In: Nature biotechnology. Band 18, Nummer 2, Februar 2000, S. 199–204, doi:10.1038/72658, PMID 10657128.
  2. ↑ J. Quan, J. Tian: Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways. In: PLOS ONE. Band 4, Nummer 7, 2009, S. e6441, doi:10.1371/journal.pone.0006441, PMID 19649325, PMC 2713398 (freier Volltext).
  3. ↑ E. C. Oriero, J. Jacobs, J. P. Van Geertruyden, D. Nwakanma, U. D’Alessandro: Molecular-based isothermal tests for field diagnosis of malaria and their potential contribution to malaria elimination. In: Journal of Antimicrobial Chemotherapy. [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] September 2014, doi:10.1093/jac/dku343, PMID 25223973.
  4. ↑ L. Yan, J. Zhou, Y. Zheng, A. S. Gamson, B. T. Roembke, S. Nakayama, H. O. Sintim: Isothermal amplified detection of DNA and RNA. In: Molecular bioSystems. Band 10, Nummer 5, Mai 2014, ISSN 1742-2051, S. 970–1003, doi:10.1039/c3mb70304e, PMID 24643211.