Einzelpartikelverfolgung

Einzelpartikelverfolgung, Einzelteilchenverfolgung oder üblicher englisch single-particle tracking (SPT) ist eine Messmethode der Physik und vor allem der Biophysik, mit der die Bahnkurven vieler (mikroskopischer) Teilchen in einem Medium (z. B. einer Flüssigkeit oder Zelle) einzeln erfasst werden können.^[1][2][3] Sie erlaubt es, die Brown’sche Molekularbewegung direkt zu beobachten und zu quantifizieren.

Beschreibung

Einzelpartikelverfolgung wird häufig in Verbindung mit verschiedenen fluoreszenzmikroskopischen Verfahren verwendet. Die zu verfolgenden Teilchen werden dann mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Liegen sie in einer so geringen Konzentration vor, dass einzelne Teilchen im Mikroskopiebild unterschieden und lokalisiert werden können, so kann Einzelpartikelverfolgung angewendet werden. Man nimmt dann eine schnelle Serie von Bildern auf und lokalisiert in jedem dieser Bilder die Teilchen. Dies ergibt für jedes Bild ${\displaystyle t}$ der Serie einen Satz von Koordinate ${\displaystyle {\vec {x}}_{i}(t)}$ der Teilchen ${\displaystyle i}$. Danach wird versucht, die Teilchenpositionen aus zwei (oder mehr) aufeinanderfolgenden Bildern einem Teilchen zuzuordnen, sodass man Trajektorien für die Teilchen erhält (Tracking). Oft ordnet man dann diejenigen Positionen ${\displaystyle {\vec {x}}_{i}(t)}$ und ${\displaystyle {\vec {x}}_{j}(t+1)}$ aus zwei aufeinanderfolgenden Bilder einander zu, die den geringsten Abstand zueinander haben.

Dieses Verfahren ergibt dann einen Satz von Trajektorien ${\displaystyle {\vec {x}}_{i}(t)}$, die einer weiteren statistischen Auswertung zugeführt werden können, um etwa Diffusionskoeffizienten oder Transportgeschwindigkeiten zu berechnen. Verschiedene Diffusionsprozesse (normale Diffusion, anomale Diffusion^[4], Diffusion in abgeschlossenen Poren^[5], gerichteter Transport durch Motorproteine entlang Aktin-Filamenten) können durch die Berechnung der mittleren quadratischen Verschiebung unterschieden werden.

Wie auch bei fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) kann leicht eine mobile von einer immobilen Fraktion (z. B. im Fall eines gebundenen Rezeptors an die extrazelluläre Matrix oder das Cytoskelett) unterschieden werden. Darüber hinaus können unterschiedlich schnell diffundierende Fraktionen (z. B. bei Oligomerisierung) quantifiziert werden.

Neben der mittleren quadratischen Verschiebung kann außerdem der mittlere Winkel zwischen aufeinanderfolgenden Verschiebungen bestimmt werden, der ein Maß für die Gerichtetheit der jeweiligen Trajektorie ist.

Mikroskopieverfahren

Für die Einzelpartikelverfolgung geeignete Fluoreszenzmikroskopieverfahren sind z. B.

• Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)^[6]
• Lichtscheibenmikroskopie (LSFM)^[7][8]

Darüber hinaus ist scanning confocal microscopy geeignet. Dabei kann immer nur ein einzelnes Teilchen verfolgt werden, dafür aber mit höherer zeitlicher Auflösung. Zum Beispiel kann der Fokus eines Konfokalmikroskops stetig in Kreisen um ein zu verfolgendes Teilchen geführt werden. Bewegt es sich, so ist die Fluoreszenzverteilung auf der Kreisbahn nicht mehr überall gleich und der Umlaufkreis des Fokus kann entsprechend verschoben werden. Die Trajektorie des Teilchens ergibt sich dann über die sukzessiven Positionen des Umlaufkreises.^[9]

Auflösung

Kamera-basierte Verfahren erreichen zeitliche Auflösungen im Bereich 1–100 ms. Mit sehr schnellen Kameras können Auflösungen von bis zu 25 µs erreicht werden.^[10]

Die räumliche Auflösung ist typischerweise besser als die Auflösung des Mikroskopieverfahrens (Faktor 1–5, oder 20–100 nm), da die Position eines einzelnen Fluorophors mit Sub-Pixel-Präzision bestimmt werden kann (siehe Photoactivated Localization Microscopy).

Einzelnachweise

1. ↑ H. Qian, M.P. Sheetz, E.L. Elson: Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. In: Biophysical Journal. Band 60, Nr. 4, Oktober 1991, ISSN 0006-3495, S. 910–921, doi:10.1016/S0006-3495(91)82125-7, PMC 1260142 (freier Volltext). 
2. ↑ Michael J. Saxton, Ken Jacobson: Single-Particle Tracking: Applications to Membrane Dynamics. In: Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. Band 26, Nr. 1, Juni 1997, ISSN 1056-8700, S. 373–399, doi:10.1146/annurev.biophys.26.1.373. 
3. ↑ Kevin Braeckmans, Dries Vercauteren, Jo Demeester, and Stefaan De Smedt: Single particle tracking. In: Alberto Diaspro (Hrsg.): Nanoscopy and multidimensional optical Fluorescence microscopy. CRC Press, 2010, ISBN 978-1-4200-7886-2, S. 5-1–5–17, doi:10.1201/9781420078893-c5. 
4. ↑ Stas Burov, Jae-Hyung Jeon, Ralf Metzler, Eli Barkai: Single particle tracking in systems showing anomalous diffusion: the role of weak ergodicity breaking. In: Physical Chemistry Chemical Physics. Band 13, Nr. 5, 2011, ISSN 1463-9076, S. 1800–1812, doi:10.1039/C0CP01879A. 
5. ↑ Thomas Bürli, Kristin Baer, Helge Ewers, Corinne Sidler, Christian Fuhrer, Jean-Marc Fritschy, Huibert D. Mansvelder: Single Particle Tracking of α7 Nicotinic AChR in Hippocampal Neurons Reveals Regulated Confinement at Glutamatergic and GABAergic Perisynaptic Sites. In: PLoS ONE. Band 5, Nr. 7, 9. Juli 2010, ISSN 1932-6203, S. e11507, doi:10.1371/journal.pone.0011507. 
6. ↑ H. Ewers, A. E. Smith, I. F. Sbalzarini, H. Lilie, P. Koumoutsakos, A. Helenius: Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 102, Nr. 42, 18. Oktober 2005, ISSN 0027-8424, S. 15110–15115, doi:10.1073/pnas.0504407102. 
7. ↑ Jörg G. Ritter, Roman Veith, Jan-Peter Siebrasse, Ulrich Kubitscheck: High-contrast single-particle tracking by selective focal plane illumination microscopy. In: Optics Express. Band 16, Nr. 10, 2008, ISSN 1094-4087, S. 7142–7152, doi:10.1364/OE.16.007142. 
8. ↑ Jörg Gerhard Ritter, Roman Veith, Andreas Veenendaal, Jan Peter Siebrasse, Ulrich Kubitscheck, Jörg Langowski: Light Sheet Microscopy for Single Molecule Tracking in Living Tissue. In: PLoS ONE. Band 5, Nr. 7, 23. Juli 2010, ISSN 1932-6203, S. e11639, doi:10.1371/journal.pone.0011639. 
9. ↑ Valeria Levi, QiaoQiao Ruan, Enrico Gratton: 3-D Particle Tracking in a Two-Photon Microscope: Application to the Study of Molecular Dynamics in Cells. In: Biophysical Journal. Band 88, Nr. 4, April 2005, ISSN 0006-3495, S. 2919–2928, doi:10.1529/biophysj.104.044230. 
10. ↑ Akihiro Kusumi, Chieko Nakada, Ken Ritchie, Kotono Murase, Kenichi Suzuki, Hideji Murakoshi, Rinshi S. Kasai, Junko Kondo, Takahiro Fujiwara: Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: High-Speed Single-Molecule Tracking of Membrane Molecules. In: Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. Band 34, Nr. 1, Juni 2005, ISSN 1056-8700, S. 351–378, doi:10.1146/annurev.biophys.34.040204.144637 (web.archive.org [PDF; 494 kB; abgerufen am 24. August 2021]).